validasi metode HPLC pada doxyxycline

TUGAS ANALISIS FARMASI

VALIDASI METODE HPLC PADA DOXYXYCLINE

Disusun oleh :

  Nama         : LAMTANA EKA KARTIKASARI                                              NIM            : K100130173

  KELAS         : B

Fakultas Farmasi

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SURAKARTA

2015

Pengembangan dan validasi metode RP-HPLC untuk penentuan doksisiklin hyclate pada urine manusia dan sediaan farmasi

Journal : “Development and validation of RP-HPLC method for the determination of doxycycline hyclate in spiked human urine and pharmaceuticals”

            Pengembangan dan validasi metode RP-HPLC untuk penentuan doksisiklin hyclate setelah dilakukan beberapa optimasi untuk mendapatkan peak area / pemisahan yang baik digunakan fase terbalik (reverse-phase) dengan fase diam kolom hypersil BDS C₈ (250 mm x 4,0 mm i.d , 5,0 µm) dengan suhu kolom 25^oC, fase gerak larutan buffer kalium dihidrogen ortophospat (pH 4,0) : acetonitril (60 : 40 v/v), dengan deteksi UV pada 325 nm, flow rate (kecepatan alir) 1,0 mL/min. Sampel yang diinjeksikan sebesar 10µL. Analisis HPLC dilakukan dengan Sistem HPLC Alliance Waters dilengkapi dengan Alliance 2657 series dengan pompa kuartener tekanan rendah, variabel yang diprogram yaitu panjang gelombang UV-detektor sinar tampak, detektor FDA Waters 2996 dan auto sampler.

                Degradasi Doksisiklin hyclate dapat terjadi karena oksidasi, hidrolisis asam basa dan fotolisis. Untuk mengujinya dilakukan dengan perlakuan doksisiklin dalam 3 pelarut yaitu 1 M HCl, 1 M NaOH atau 1% H₂O₂.

                        Hasil validasi metode RP-HPLC dalam penetapan doksisiklin hyclate. Rata-rata waktu retensi 3,110 min (n=10). Linearitas doksisiklin hyclate dalam sediaan farmasi didapatkan nilai r = 0,9974, dengan range konsentrasi 30-300 µg/mL DOX (doxycycline). LOD yang didapatkan 0,02 µg/mL dan LOQ 0,1 µg/mL. Semakin kecil nilai LOD dan LOQ maka semakin sensitif dan spesifik metode dan hasilnya. Presisi di evaluasi dengan membuat 3 seri konsentrasi yaitu 50, 100 dan 150 µg/mL pada hari yang sama. Untuk presisi dan akurasi intra-day (hari yang sama) nilai rata-rata RSD berdasarkan waktu retensi (0,23 %) > baik dari RSD berdasarkan peak areanya (0,52 %). Sedangkan nilai presisi dan akurasi inter-day (hari yang berbeda) nilai rata-rata RSD berdasarkan waktu retensi (0,34 %) > baik dari RSD berdasarkan peak areanya (1,08 %).

            Penetapan doksisiklin hyclate dalam sampel urine, hasilnya hampir sama dengan doksisiklin dalam sediaan farmasi (tablet). Konsentrasi yang digunakan 100 µg/mL didapatkan % Recovery+ RSD 101,4+ 0,005 dan dalam konsentrasi 200 µg/mL hasilnya % Recovery+ RSD 103,2 + 0,033. Jika dilihat dari hasil % recovery dan RSD nya maka validasi metode dengan RP-HPLC dalam penetapan doksisiklin hyclate dalam sampel urin ini baik.

            Keuntungan metode RP-HPLC misalnya kolom rendah bertekanan balik, baik bentuk puncak kromatografi, meningkatkan efisiensi kolom, plate teoritis yang lebih tinggi dan konsistensi dalam waktu retensi dan runtime sehingga memungkinkan analasis dengan cepat.

Pengembangan dan Validasi Metode RP-HPLC untuk estimasi simultan Doksisiklin hyclate (DOX) dan Tinidazol (TIZ) dalam sediaan farmasi

Journal : “Development and validation of rp-hplc method for simultaneous estimation of doxycycline hyclate and tinidazole in bulk and tablet dosage form”

            Metode HPLC dapat digunakan untuk penetapan obat tunggal atau dalam formulasi gabungan. Tujuan validasi metode ini untuk mengembangkan dan memvalidasi metode yang akurat, sensitif, cepat dan isokratik. Metode RP-HPLC digunakan untuk penentuan doxyxycline hyclate (DOX) dan Tinidazol (TIZ) dalam sediaan tablet. Untuk pemisahan ini digunakan reverse phase (fase terbalik) dengan fase diam kolom Zorbax C8 (250mm × 4.6mm, 5μm) , fase gerak Kalium dihidrogen orto fosfat 20mM (pH 6, disesuaikan dengan trietilamina) : Asetonitril (60:40% v / v) dengan kecepatan aliran 1 mL/menit. Deteksi dengan UV pada 293 nm.

            Dari konsentrasi DOX yang dibuat 10-50 µg/mL RSD rata-rata yang didapatkan 0,8931 dan r yang didapat 0,9993. Hasil % Recovery DOX dan % RSD nya bagus. Untuk repeatabilitas dari 50 µg/mL DOX didapatkan RSD 0,1558%. Sedangkan nilai presisi intra-day hasil rata-rata RSD sebesar 0,653%, untuk inter- day RSD-nya 0,733. Untuk LOD dan LOQ doxyxycline hyclate sebesar 4,7 dan 7,5 µg/mL. Sehingga cukup selektif dan sensitif.

            Dapat disimpulkan bahwa formulasi yang mengandung obat antibakteri (DOX dan TIZ) yang dikembangkan dengan metode RP-HPLC lebih sensitif, tepat, spesifik, dan akurat. Metode ini cukup selektif, dibuktikan dari tidak adanya puncak lain di sekitar kromatogram yang mengganggu waktu retensi DOX dan TIZ tetapi metode RP-HPLC yang dikembangkan untuk penentuan simultan Doxycycline hyclate dan Tinidazol dalam sediaan farmasi lebih mahal dibandingkan dengan metode Spektrofotometri.

kromatografi lapis tipis

MAKALAH KROMATOGRAFI

ANALISIS ASAM AMINO DENGAN KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS ( KLT )

Disusun oleh:

Nama         : LAMTANA EKA KARTIKASARI

NIM            : K100130173

KELAS        : A

Fakultas Farmasi

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SURAKARTA

2014

PENDAHULUAN

Kromatografi lapis tipis adalah metode kromatografi cair yang paling sederhana yaitu suatu pemisahan senyawa yang amat berbeda seperti senyawa orgnik alam dan senyawa organic sintetik, kompleks anorganik-organik , dan bahkan ion anorganik dapat dilakukan dlam beberapa menit dengan alat yang harganya tidak terlalu mahal. Jumlah cuplikan serendah beberapa microgram atau setinggi 5 g dapat ditangani, bergantung pada alat yang ada dan gejala kromatografi yang terlibat. Kelebihan KLT yang lan ialah pemakaian pelarut dan cupilkan yang jumlahnya sedikit, kemungkinan penotolan cuplikan berganda (saling membandingkan langsung cuplikan praktis, dan tersedianya bebagai metode (seperti KCP, KCC, dan kromatografi eksklusi).

KLT dapat dipakai dengan dua tujuan yaitu yang pertama ,diapaki selayaknya sebagai metode untuk mencapai hasil kualiatif, kuantitatif atau preparative. Kedua dipakai untuk menjajaki system pelarut dan system penyangga yang akan dipakai dalam kromatografi cair kinerja tinggi.

                                                            (Gritter Roy, 1991)

Gambaran utama yang mengatur kemampuan daya pisah lempeng KLT adalah ukuran bercak (spot) dan dimensi fisik lempeng , dengan diameter sebesar 0,5 cm dan panjang lempeng pada umumnya 10 cm. dengan ukuran seperti ini, lempeng hanya mampu memisahkan 20 analit secara optimal supaya terpisah secara sempurna. Meskipun demikian , dengan penghantaran kapiler normal eluat, maka lempeng teoritis maksimum adalah <5000. Kecepatan fase gerak bervariasi disepanajang lempeng KLT, semakin jauh fase gerak melewati lempeng maka kecepatan akan menurun.

Dalam KLT dan juga kromatografi kertas, hasil-hasil yang diperoleh digambarkan dengan mencantumkan nilai Rf-nya yang merujuk pada migrasi relative analait terhadap ujung depan fase gerak atau eluen, dan nilai ini terkait dengan koefisien distribusi komponen.

                        (Ibnu Ghalib  dan Gandjar, 2012)

METHOD

            Disiapkan 2 chamber yang bisa mengakomodasi lembaran 20 cm². Kita menggunakan KLT shandon chamber untuk memastikan penjenuhan dari lapisan chamber tank itudengan pelarut, dua dinding dari tiap chamber diberi garis internal dengan menandai pada kertas, dan ca. 100 mL dari pelarut dimasukkan dalam chamber sebelum proses elusi. Selulosa yang ditutupi lapisan alumunium (20x20 cm) ditandai dengan tujuh titik 1,5 cm dari dua sisi kertas. Dan digaris sejajar 15,5 cm dari sisi tersebut. Disiapkan dinding sel yang telah terhidrolisis. Sel tersebut di saring dengan trichloro acetic-acid-trypsin suhu tinggi. Tiap dua dimensional analisis memerlukan 2 – 4 µL hydrolysate, dan ukuran totolan sampel harus minimal. Pada bidang kertas, ditandai 4,5 dari lebarnya, digunakan untuk 1 dimensi elusi dari smpel asam amino pada tiap solvent. Solvent untuk 1 dimensi adalah isopropil : asam asetat : air (75 : 10 : 15). Kromatogram dikeringkan satu malam pada suhu ruangan atau di oven pada suhu 105^oC tidak lama. Solvent kedua adalah methanol : lpyridine : 10N hydrochloricacid : water (64:8:2:14) smpai mencapai tanda 15,5 cm. Jika elusi pada cromatogram sudah selesai, dikeringkan dan divisualisasi dengan 0,2 % ninhidrin dalam aseton dengan menyemprotkannya dan memanaskannya pada suhu 105^oC.

                                                                               (J. J. HARPER AND G. H. G. DAVIS , 1979)

PEMBAHASAN

            Pemisahan yang berdasaran partisi cair-cair dari komponen diantara dua fase yang tidak bisa bercampur. Dalam kromatografi kertas , serat hidrat selulosa dari kertas digunakan sebagai fase diam. Dalam kromatografi lapis tipis, lapisan tipis silika gel sebagai fase diam. KLT menggantikan kromatografi kertas karena plat silika lebih mudah digunakan daripada kertas, dan pemisahannya lebih tajam. Setelah proses elusi selesai, plat silika dikeringkan dan disemprot dengan larutan ninhidrin dan dihangatkan supaya diketahui letak asam amino pada plat tersebut. Ninhidrin bereaksi dengan asam amino untuk membentuk kompleks warna, sehingga asam amino dpat dideteksi pemisahannya.       

            Ekstrak dinding sel hasil hidrolisis tersusun atas sedikit membran dan komponen lain. Sensitivitas dari kromatografi lapis tipis adalah lebih besar daripada kromatografi kertas yang sedikit terdeteksi. Dalam bakteri gram positif dinding selnya asam amino lebih dari tiga atau empat, sehingga bercaknya lebih tebal dan besar.perbedaan metode yang digunakan dalam kromatografi lapis tipis ini akan memberikan hasil yang berbeda pula dalam pemisahannya.

                                                                                                                                (J. J. HARPER AND G. H. G. DAVIS , 1979)

           

                Nilai Rf dipengaruhi kuat oleh kondisi eksperimen, misalnya komposisi eluent, kelembaban kertas, dan juga suhu.

            Fase gerak akan naik keatas dengan gaya kapiler ketika plat dimasukkan dalam eluent pada chamber kromatografi. Ketika eluent menggerak an komponen dari sampel, maka sampel tersebut akan terpisah komponen-komponennya yang disebabkan interaksi anatara molekul dengan eluent.

            Campuran dari asam amino dapat dipisahkan dengan kromatografi kertas. Pemisahan asam amino divisualisasikan dengan larutan ninhidrin. Warna ungu akan berkembang selama reaksi antara asam amino dengan ninhidrin. Untuk pemisahan substansi secara visual (jika tidak berwarna) menggunakan teknik yang berbeda : rekasi kimia, menambahkan indikator flourescence ke lapisan absorbent selama proses penyiapan plat atau menyemprotkan larutan flourescence ke plat tersebut atau dilihat dibawah sinar UV.                                                                                                                                                                                         http://tera.chem.ut.ee/~koit/arstpr/ah_en.pdf

            Asam amino tidak bisa dilihat dengan mata biasa ketika diaplikasikan dengan KLT. Oleh karena itu setelah proses elusi dengan plat KLT dibutuhkan sistem untuk mendeteksi asam amino. Misalnya reagent ninhidrin digunakan untuk deteksi dan untuk mengukur asam amino dan peptida. Ninhidrin akan mengoksidasi agen sangat kuat yaitu mengoksidasi asam amino meghasilkan amonia, CO2, aldehid yang sesuai, dan bentuk reduksi dari ninhidrin yang disebut hydrinatin.                                                        

                                                                                                                 (Lehninger, Nelson, and Cox, 1993)

            Selain dengan reagent ninhidrin dapat juga dengan disemprotkan reagent 6-pyridin-2-yl-5,6 dihydro-benzo [4,5] imidazo [1,2-c] quinazoline (PDBIQ). Analisis struktural oleh spektroskopi dan sinar X. Rancangan quinazoline didasarkan penyemprotan reagen PDBIQ pada kromatografi lapis tipis dapat dibedakan warnanya tiap asam amino.                                                                                  

                                                                                                                http://dx.doi.org/10.4236/ajac.2012.39088

KESIMPULAN

            Analisis asam amino dengan kromatografi lapis tipis tidak bisa dilihat langsung dengan mata biasa, sehingga untuk melihat hasil elusinya maka ditambahkan reagent ninhidrin supaya membentuk warna ungu sehingga asam amino dapat terdeteksi.

DAFTAR PUSTAKA

Gandjar, Ibnu Gholib, abdul rohman, Analisis Obat secara Spektrofotometri           dan Kromatografi, Pustaka Pelajar : Yogyakarta

            J. J. HARPER AND G. H. G. DAVIS, 1979 Department of Microbiology,                                     University of Queensland, St. Lucia,        Brisbane, Australia                                         INTERNATIONAL JOURNAL OF SYSTEMATIC                                               BACTERIOLOGY, p. 56-58VOL.29 NO. 1

            Lehninger, Nelson, and Cox, 1993, Principles of Biochemistry, 2nd                                                 ed.

Roy, J Gritter, 1991, Pengantar Kromatografi edisi kedua, ITB : Bandung

            Stryer; 1995, Biochemistry, 4th ed                        

            http://tera.chem.ut.ee/~koit/arstpr/ah_en.pdf                 

                http://dx.doi.org/10.4236/ajac.2012.39088