laporan kromatografi kolom

LAPORAN PRAKTIKUM KROMATOGRAFI

KROMATOGRAFI KOLOM

( Separation Of Dyes Using Column Cromatography )

Disusun oleh:

Kelompok  : H.6

Laboratorium Kromatografi

Bagian Kimia Farmasi Fakultas Farmasi

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SURAKARTA

2014

I.                     TUJUAN

a.       Memahami teori dan prinsip-prinsip dasar kromatografi kolom

b.       Memisahkan 2 zat menggunakan kromatografi kolom

c.       Melakukan analisis kulitatif atau kuantitatif zat yang terpisah dari kromatografi kolom

II.                   DASAR TEORI

Kolom kromatografi dapat berupa pipa gelas yang dilengkapi dengan kran dan gelas penyaringdi dalamnya. Ukuran kolom tergantung pada banyaknya zat yang akan dipisahkan. Untuk menahan penyerap yang diletakkan di dalam kolom dapat digunakan gelas wool atau kapas.

Pengisian kolom yang tidak teratur dari penyerap akan mengakibatkan merusak batas batas pita kromatografi. Putusnya penyerap dalam kolom biasanya disebabkan oleh gelmbung-gelembung udara selama pengisian. Untuk mencegah hal-hal tersebut sedapat mungkin zat pengisi/penyerap dibuat menjadi bubur dengan pelarut kemudian dituangkan perlahan-lahan dalam tabung. Harus diperhatikan penyerap yang  telah dimasukkan jangan sampai ada bagian yang kering baik selama pengisian atau pemisahan.

                                                        (Sastrohamidjojo, Hardjono, 2005)

Migrasi dan Retensi Solut 

Kecepatan migrasi solute melalui fase diam ditentukan oleh perbandingan distribusinya (D) , dan besarnya D ditentukan oleh afinitas relative solute pda kedua fase (fase diam dan fase gerak). Dalam konteks kromatografi, nilai D didefinisikan sebagai perbandingan konsentrasi solute dalan dalam fase  diam (Cs) dan dalam fase gerak (Cm) .

                                                                           (Rohman, Abdul, 2009)

Semakin besar nilai D, maka migrasi solut semakin lambat, dan semakin kecil nilai D, migrasi solute semakin cepat. Solute akan terelusi menurut perbandingan distribusinya. Jika perbedann distribusi antar solute cukup besar maka campuran-campuran  solute akn mudah dan cepatndipisahkan.

                                                                          (Rohman, Abdul, 2009)

Berdasarkan pada mekanisme pemisahannya, kromatografi dibedakan menjadi :

·                       Kromatografi adsorbs

·                       Kromatografi partisi

·                       Kromatografi afinitas

·                       Kromatografi pasangan ion

·                       Kromatografi penukar ion

·                       Kromatografi eksklusi ukuran

Kromatografi Adsorbsi

Adsorbsi  merupakan penyerapan pada permukaannya saja. Adsorbs pada permukaan melibatkan interaksi interaksi elektrostatik, seperti  ikatan hydrogen, penarikan dipole-dipol dan penarikan yang diinduksi oleh dipole. Solute akan bersaing dengan fase gerak untuk berikatan.

Permukaan silica gel terdiri atas gugud Si-OH. Gugus silanol bersifat sedikit asam dan polar karenanya gugus ini mampu membentuk ikatan hydrogen dengan solute-solute yang agak polar sampai sangat polar.

Kromatografi Partisi

Partisi merupakam proses adsorpsi yang analog dengan ekstraksi pelarut. Fase diam cair diikatkan pada padatan lapis tipis yang inert. Karena fase diam cair diikatkan pada padatan pendukung maka masih diperdebatkan apakah proses adsorpsinya merupakan partisi murni atau partisi yang dimodifikas karena adsorpsinya juga mungkin terjadi. Dalam partii yang sebenarnyasolut akan terditribusi diantara fase gerak dan fase diam sesuain dengan kelarutan relative diantara keduanya. Mekanisme partisi mungkin hanya terjadi dalam kromatogrfi gas-cair.                                                                                                                                             (Rohman dan Gandjar, 2007)

III.                 ALAT DAN BAHAN

a.       ALAT :

Pipet kolom, Kapas, Botol flakon, Bekker glass, Gelas ukur, Pipet tetes, Pipet volume, Pipa kapiler, Pompa vacum, Chamber dan penutupnya.

b.      BAHAN :

       Methanol, Kloroform, Silica, Campuran metil merah dan metil          orange, Metil merah, dan Metil orange.

IV.                CARA KERJA SKEMATIS

v Pemisahan kolom untuk pemisahan senyawa

Disiapkan kolom untuk pemisahan senyawa.

Disiapkan silica yang sudah dipanaskan dalam oven dan kapas.

Dimasukkan kapas pada bagian bawah kolom dan dimasukkan silica (2/3 dari tinggi kolom) pada kolom sampai kompak.

Disiapkan 15 ml ethanol.

 

Diteteskan ethanol ke dalam kolom untuk membasahi silica.

 

Dijaga agar silica selalu basah jaga ethanol 1 cm diatas silica. Sampai kolom terlihat bening.

 

Ditambahkan cairan fase gerak (methanol : kloroform = 1 : 1) secara perlahan hingga 1 cm diatas silica.

 

Diambil sampel dan di masukkan ke dalam kolom dan divacum jangan sampai fase gerak habis dan harus ditambahkan terus fase gerak, agar tidak terjadi crack atau kolom pecah.

 

Saat tetesan pertama sampel ditaruh flakon dipindah pada flakon lain jika volume mencapai 2 ml. Perpindahan flakon dihentikan jika kolom bertetes bening.

V.                  HASIL PERCOBAAN DAN PERHITUNGAN

Pada KLT :

KEL.	FASE GERAK	KEKUATAN ELUSI	RF			Volume Retensi
			M.O	Sampel	MM	MO	MM
1	MeOH : CHCl3 ( 0,5 : 1,5 )	0,5375	0,525	-	0,95	4 mL	6 mL
2	MeOH : Etil Asetat ( 0,5 : 1,5 )	0,6725	0,5	-	0,8	6 mL	14 mL
3	MeOH : CHCl3 ( 1 : 2 )	0,5837	0,6	-	0,95	-	-
4	MeOH : Etil Asetat ( 0,5 : 1,5 )	0,6725	0,45	-	0,8	6 mL	6 mL
5	MeOH : CHCl3 ( 0,5 : 1,5 )	0,5375	0,525	-	0,95	4 mL	8 mL
6	MeOH : CHCl3 ( 1 : 1 )	0,675	0,725	0,7 dan 0,95	0,95	4 mL	8 mL
7	MeOH : CHCl3 ( 1 : 2 )	0,5837	0,225	-	0,825	4 mL	4 mL
8	MeOH : CHCl3 ( 1 : 1 )	0,675	0,825	0,85 dan 0,95	0,95	6 mL	4 mL

PERHITUNGAN

·        KLT ( Kromatografi Lapis Tipis )

Kelompok 1

Kelompok 2

Kelompok 3

Kelompok 4

Kelompok 5

Kelompok 6

Kelompok 7

Kelompok 8

· Kekuatan Elusi

·      Methanol = 0,95

·      Kloroform = 0,40

·      Etil asetat = 0,58

Methanol : Kloroform (0,5 : 1,5) = (0,5/2 x0,95) + (1,5/2 x 0,40)

                                                                                = 0,2375 + 0,3 = 0,5375

Methanol : Kloroform (1 : 2)        = (1/3 x 0,95) + (2/3 x 0,40)

                                                                                = 0,3167+0,267 = 0,5837

Methanol : Kloroform (1 : 1)        = (1/2 x 0,95) + (1/2x 0,40)

                                                                                =0,475+0,2 = 0,675

Methanol : Etil asetat (0,5 : 1,5)  = (0,5/2x0,95) + (1,5/2x 0,58)

                                                                                = 0,2375+0,435 = 0,6725

VI.     PEMBAHASAN

                Dari percobaan yang kami lakukan yaitu kromatografi kolom dan kromatografi ini memberikan tujuan menjelaskan teori dan prinsip dasar kromatografi kolom, melakukan pemisahan dengan berbagai teknik kromatografi kolom,  serta melaksanakan analisis kualitatif maupun kuantitatif dari pemisahan menggunakan kromatografi kolom.

                Pada praktikum ini kromatografi kolom ini, kolom yang kita gunakan adalah pipet pasteur atau yang sering disebut pipet tetes. Kromatografi kolom termasuk dalam LC (liquid chromatography) karena fase diamnya padatan, fase geraknya cairan, dan sampel berupa cairan. Fase diam yang digunakan yaitu silika. Fase diam yaitu suatu zat/senyawa/lapisan pada medium pendukung yang berinteraksi dengan analit. Jadi, fase diam itu bisa bergerak karena dialirkan, bila tidak dialirkan maka tertahan. Fase diam dapat berupa padatan maupun cairan. Sedangkan fase gerak yaitu pelarut ( solvent ) yang mengalir/ bergerak sepanjang media pendukung, biasanya berupa cairan maupun gas.

                Pengisian silica kedalam kolom bisa dilakukan dengan 2 metode, yaitu metode basah maupun kering. Tetapi dlam praktikum ini kita menggunakan metode kering. Metode kering adalah dengan memasukkan silica dalam kolom dengan tinggi silica 2/3 dari panjang kolom, untuk kelompok kami panjang kolomnya adalah 16 cm, jadi tinggi silica pada kolom kurang lebih 10,3 cm kemudian dialiri dengan ethanol. Sedangkan cara basah adalah dengan melarutkan silika dengan pelarut tidak langsung pada kolom, jadi silika itu dibuat larutan dulu kemudian dimasukkan ke dalam kolom. Keuntungan dari cara basah yaitu silika dapat terlarut dan tercampur merata, sehingga bubur silica menjadi homogen. Pembuatan fase diam dengan cara kering ini harus hati-hati, karena bisa saja kolomnya pecah atau crack karena solventnya tidak dijaga, jadi dalam pembuatan fase diam dengan cara kering ini silika harus ditetesi dengan ethanol terus menerus jangan smpai kering, dilihat jika ditetesi ethanol tetapi bagian bawah tidak menetes maka perlu pompa vacum untuk membantu mengalirkannya. Fungsi glass wol / kapas pada praktikum ini adalah menyumbat kolom bagian bawah supaya silica tidak mengalir keluar kolom.

                Sampel yang digunakan untuk pemisahan ini yaitu campuran metil merah (m.m ) dan metil orange (m.o), dan fase geraknya adalah campuran methanol : kloroform (1 : 1). Sebelum percobaan kromatografi kolom, kita melakukan KLT terlebih dahulu. Fase gerak pada KLT adalah plat KLT, dan fase geraknya sama seperti yang digunakan untuk kromatogerafi kolom nanti.

                Dari KLT , kita dapatkan Rf (retardation factor) yaitu jarak migrasi solute terhadap jarak pengembangan. Rf untuk m.m adalah 0,95 sedangkan untuk Rf m.o adalah 0,725, dari nilai Rf ini dapat dikatakan yang terelusi lebih dulu adalah metil merah karena besifat agak polar jika dibanding metil orange. Metil merah memiliki sifat seperti fase geraknya yaitu nonpolar, sehingga akan terelusi lebih dulu. Metil orange akan tertahan pada fase diam karena keduanya memiliki sifat yang sama polar. Sedangkan sampel campuran metil merah dan metil orange memiliki 2 nilai Rf, yaitu 0,7 dan 0,95. Dapat disimpulkan bahwa dari sampel tersebut yang Rf nya tinggi adalah metil merah karena terelusi lebih dulu dan cepat.

                Sebelum plat dimasukkan chamber, chamber harus dijenuhkan lebih dulu dengan cara fase gerak yang akan digunakan dimasukkan camber kemudian dimasukkan kertas saring yang telah diberi batas atas dan batas bawah supaya kita tahu batas chamber jenuh. Tujuan penjenuhan adalah agar elusi dapat berjalan cepat. Batas bawah harus ditentukan supaya totolan sampel tidak langsung terendam fase gerak, yang dapat mempengaruhi proses elusinya.

                Pad kromatografi kolom, fase gerak yang digunakan adalah methanol : kloroform yang punya sifat nonpolar. Setelah fase diam telah jadi, dimasukkan sampel kemudian ditetesi fase gerak. Dijaga agar fas gerak pada kolom tidak sampai kering, supaya tidak mengeras dan pecah kolomnya. Kromatografi kolom ini prinsipnya gravitasi karena cairan mengalir dari atas ke bawah. Tiap 2 mL larutan yang keluar kolom ditampung pada flakon, sehingga pada kelompok kami didapatkan 4 mL metil merah dan 6 mL metil orange. Waktu retensi untuk metil merah adalah 3’ 45” dan untuk metil orange 6’3”. Jka kita bandingkan dengan kelompok 8 yang fase geraknya sama, mereka mendapatkan volume metil merah 8 mL dengan waktu retensi 5’56” sedangkan metil orange 4 mL punya waktu retensi 1’51”. Jika pada KLT Rf pada metil orange hasinya lebih besar 0,1 daripada kelompok kami sedangkan pada metil merah Rf nya sama. Perbedaan nilai Rf ini mungkin karena besar kecilnya penotolan pada plat KLT. Perbedaan volume retensi pada fase gerak methanol : kloroform (1 :1) kemungkinan fase diam yang belum compact dan kecepatan pompa vacum untuk membantu mengalirkan larutan keluar kolom. 

                Dari tabel hasil percobaan dapat dilihat bahwa kelompok 2 mendapatkan volume retensi terbesar m.m yaitu 14 mL dan m.o adalah 6 mL, fase gerak yang mereka gunakan adalah methanol : etil asetat (0,5 :1,5), jadi dapat disimpulkan bila proses pemisahan sempurna pada praktikum kelas kami adalah menggunakan fase gerak methanol : etil asetat (0,5 :1,5) , kelompok 4 dengan fase gerak yang sama mendapatkan volume retensi m.m yaitu 6 mL dan m.o adalah 6 mL.

VII.  KESIMPULAN

Dari percobaan ini dapat disimpulkan bahwa fase gerak yang digunakan akan memberikan pengaruh terhadap pemisahan sampel ( campuran metil merah dan metil orange ). Metil merah terelusi lebih dulu karena memiliki kesamaan sifat dengan fase geraknya.

VIII.            DAFTAR PUSTAKA

Gandjar, Rohman.,2007,Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar :           Yogyakarta

Rohman, Abdul,2009,Kromatografi Untuk Analisis obat, Elphra Ilmu :    Yogyakarta

Sastrohamidjojo, hardjono,2005,Kromatografi, Liberty : Yogyakarta