MAKALAH
KROMATOGRAFI
ANALISIS
ASAM AMINO DENGAN KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS ( KLT )
Disusun oleh:
Nama : LAMTANA
EKA KARTIKASARI
NIM : K100130173
KELAS : A
Fakultas
Farmasi
UNIVERSITAS
MUHAMMADIYAH SURAKARTA
2014
PENDAHULUAN
Kromatografi
lapis tipis adalah metode kromatografi cair yang paling sederhana yaitu suatu
pemisahan senyawa yang amat berbeda seperti senyawa orgnik alam dan senyawa
organic sintetik, kompleks anorganik-organik , dan bahkan ion anorganik dapat
dilakukan dlam beberapa menit dengan alat yang harganya tidak terlalu mahal.
Jumlah cuplikan serendah beberapa microgram atau setinggi 5 g dapat ditangani,
bergantung pada alat yang ada dan gejala kromatografi yang terlibat. Kelebihan
KLT yang lan ialah pemakaian pelarut dan cupilkan yang jumlahnya sedikit,
kemungkinan penotolan cuplikan berganda (saling membandingkan langsung cuplikan
praktis, dan tersedianya bebagai metode (seperti KCP, KCC, dan kromatografi
eksklusi).
KLT
dapat dipakai dengan dua tujuan yaitu yang pertama ,diapaki selayaknya sebagai
metode untuk mencapai hasil kualiatif, kuantitatif atau preparative. Kedua
dipakai untuk menjajaki system pelarut dan system penyangga yang akan dipakai
dalam kromatografi cair kinerja tinggi.
(Gritter
Roy, 1991)
Gambaran
utama yang mengatur kemampuan daya pisah lempeng KLT adalah ukuran bercak
(spot) dan dimensi fisik lempeng , dengan diameter sebesar 0,5 cm dan panjang
lempeng pada umumnya 10 cm. dengan ukuran seperti ini, lempeng hanya mampu
memisahkan 20 analit secara optimal supaya terpisah secara sempurna. Meskipun
demikian , dengan penghantaran kapiler normal eluat, maka lempeng teoritis
maksimum adalah <5000. Kecepatan fase gerak bervariasi disepanajang lempeng
KLT, semakin jauh fase gerak melewati lempeng maka kecepatan akan menurun.
Dalam
KLT dan juga kromatografi kertas, hasil-hasil yang diperoleh digambarkan dengan
mencantumkan nilai Rf-nya yang merujuk pada migrasi relative analait terhadap
ujung depan fase gerak atau eluen, dan nilai ini terkait dengan koefisien
distribusi komponen.
(Ibnu
Ghalib dan Gandjar, 2012)
METHOD
Disiapkan
2 chamber yang bisa mengakomodasi lembaran 20 cm2. Kita menggunakan
KLT shandon chamber untuk memastikan penjenuhan dari lapisan chamber tank
itudengan pelarut, dua dinding dari tiap chamber diberi garis internal dengan
menandai pada kertas, dan ca. 100 mL dari pelarut dimasukkan dalam chamber
sebelum proses elusi. Selulosa yang ditutupi lapisan alumunium (20x20 cm)
ditandai dengan tujuh titik 1,5 cm dari dua sisi kertas. Dan digaris sejajar
15,5 cm dari sisi tersebut. Disiapkan dinding sel yang telah terhidrolisis. Sel
tersebut di saring dengan trichloro acetic-acid-trypsin suhu tinggi. Tiap dua
dimensional analisis memerlukan 2 – 4 µL hydrolysate, dan ukuran totolan sampel
harus minimal. Pada bidang kertas, ditandai 4,5 dari lebarnya, digunakan untuk
1 dimensi elusi dari smpel asam amino pada tiap solvent. Solvent untuk 1
dimensi adalah isopropil : asam asetat : air (75 : 10 : 15). Kromatogram
dikeringkan satu malam pada suhu ruangan atau di oven pada suhu 105oC
tidak lama. Solvent kedua adalah methanol : lpyridine : 10N hydrochloricacid :
water (64:8:2:14) smpai mencapai tanda 15,5 cm. Jika elusi pada cromatogram
sudah selesai, dikeringkan dan divisualisasi dengan 0,2 % ninhidrin dalam
aseton dengan menyemprotkannya dan memanaskannya pada suhu 105oC.
(J.
J. HARPER AND
G. H. G.
DAVIS , 1979)
PEMBAHASAN
Pemisahan
yang berdasaran partisi cair-cair dari komponen diantara dua fase yang tidak
bisa bercampur. Dalam kromatografi kertas , serat hidrat selulosa dari kertas
digunakan sebagai fase diam. Dalam kromatografi lapis tipis, lapisan tipis
silika gel sebagai fase diam. KLT menggantikan kromatografi kertas karena plat
silika lebih mudah digunakan daripada kertas, dan pemisahannya lebih tajam.
Setelah proses elusi selesai, plat silika dikeringkan dan disemprot dengan
larutan ninhidrin dan dihangatkan supaya diketahui letak asam amino pada plat
tersebut. Ninhidrin bereaksi dengan asam amino untuk membentuk kompleks warna,
sehingga asam amino dpat dideteksi pemisahannya.
Ekstrak
dinding sel hasil hidrolisis tersusun atas sedikit membran dan komponen lain.
Sensitivitas dari kromatografi lapis tipis adalah lebih besar daripada
kromatografi kertas yang sedikit terdeteksi. Dalam bakteri gram positif dinding
selnya asam amino lebih dari tiga atau empat, sehingga bercaknya lebih tebal
dan besar.perbedaan metode yang digunakan dalam kromatografi lapis tipis ini
akan memberikan hasil yang berbeda pula dalam pemisahannya.
(J. J. HARPER AND G. H. G. DAVIS , 1979)
Nilai Rf dipengaruhi kuat oleh
kondisi eksperimen, misalnya komposisi eluent, kelembaban kertas, dan juga
suhu.
Fase gerak akan naik
keatas dengan gaya kapiler ketika plat dimasukkan dalam eluent pada chamber
kromatografi. Ketika eluent menggerak an komponen dari sampel, maka sampel
tersebut akan terpisah komponen-komponennya yang disebabkan interaksi anatara
molekul dengan eluent.
Campuran dari asam amino
dapat dipisahkan dengan kromatografi kertas. Pemisahan asam amino
divisualisasikan dengan larutan ninhidrin. Warna ungu akan berkembang selama
reaksi antara asam amino dengan ninhidrin. Untuk pemisahan substansi secara
visual (jika tidak berwarna) menggunakan teknik yang berbeda : rekasi kimia, menambahkan
indikator flourescence ke lapisan absorbent selama proses penyiapan plat atau
menyemprotkan larutan flourescence ke plat tersebut atau dilihat dibawah sinar UV. http://tera.chem.ut.ee/~koit/arstpr/ah_en.pdf
Asam amino tidak bisa
dilihat dengan mata biasa ketika diaplikasikan dengan KLT. Oleh karena itu
setelah proses elusi dengan plat KLT dibutuhkan sistem untuk mendeteksi asam
amino. Misalnya reagent ninhidrin digunakan untuk deteksi dan untuk mengukur
asam amino dan peptida. Ninhidrin akan mengoksidasi agen sangat kuat yaitu
mengoksidasi asam amino meghasilkan amonia, CO2, aldehid yang sesuai, dan
bentuk reduksi dari ninhidrin yang disebut hydrinatin.
(Lehninger, Nelson,
and Cox, 1993)
Selain dengan reagent ninhidrin dapat juga dengan
disemprotkan reagent 6-pyridin-2-yl-5,6 dihydro-benzo [4,5] imidazo [1,2-c]
quinazoline (PDBIQ). Analisis struktural oleh spektroskopi dan sinar X. Rancangan
quinazoline didasarkan penyemprotan reagen PDBIQ pada kromatografi lapis tipis
dapat dibedakan warnanya tiap asam amino.
KESIMPULAN
Analisis asam amino dengan kromatografi lapis tipis
tidak bisa dilihat langsung dengan mata biasa, sehingga untuk melihat hasil
elusinya maka ditambahkan reagent ninhidrin supaya membentuk warna ungu
sehingga asam amino dapat terdeteksi.
DAFTAR
PUSTAKA
Gandjar, Ibnu Gholib, abdul rohman, Analisis Obat secara Spektrofotometri dan Kromatografi, Pustaka Pelajar
: Yogyakarta
J.
J. HARPER AND G. H. G. DAVIS, 1979 Department
of Microbiology, University of
Queensland, St. Lucia, Brisbane, Australia INTERNATIONAL
JOURNAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY,
p. 56-58VOL.29 NO. 1
Lehninger, Nelson, and Cox, 1993, Principles of Biochemistry, 2nd ed.
Roy, J Gritter, 1991, Pengantar Kromatografi edisi kedua, ITB
: Bandung
Stryer; 1995, Biochemistry, 4th ed
Tidak ada komentar:
Posting Komentar